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　　智立中特(武漢)生物科技有限公司主要致力于質粒微生物資源的保護、共享和持續利用，圍繞我國生命科學研究、生物技術創新和產業發展等重大需求，探索、發現、收集國內外的微生物資源，妥善長期保存管理;在保證生物安全和保護知識產權的前提下，為工農業生產、衛生健康、環境保護、科研教育提供質粒載體物物種資源、基因資源、信息資源和專業技術服務。旗下質粒載體網是一款提供質粒載體展示及定制的專業型網站，由智立中特(武漢)生物科技有限公司聯合多家企業公司科研院校共同打造!主要展示了各種基因類型下的質粒載體!

　　我們的工作主要包括：廣泛分離、收集、保藏、交換和供應各類微生物質粒菌種;保存用于專利程序的各種可培養生物材料;質粒載體類保藏技術研究;微生物分離、培養技術研究;微生物鑒定和復核技術研究;保藏菌種的資料情報收集和提供及編輯微生物菌種目錄。

　　目前保存各類載體資源超過20000余種 ，質粒微生物約5000株，另外我們還代理國外微生物菌種資源，如addgene，安捷倫，thermo，atcc等。

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　　細胞特性

　　1) 來源：小鼠，氣道

　　2) 形態：成纖維樣，貼壁生長

　　3) 含量：>1x106  細胞數

　　4) 規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

　　5)用途：僅供科研使用。

　　運輸和保存

　　干冰運輸及復蘇好存活細胞

　　(1)1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。

　　(2)T25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

　　細胞接收后的處理

　　1)收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

　　2)請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照(10×，20×)各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態的依據。

　　3)貼壁細胞：細胞在37℃培養箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養瓶中灌液培養基(若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養瓶中),加入新配制的完全培養基6-8mL，放到細胞培養箱中繼續培養。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

　　4)備注：運輸用的培養基(灌液培養基)不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的完全培養基來培養細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養瓶1：2傳代 。

　　細胞培養步驟

　　一.培養基及培養凍存條件準備

　　1) 準備1640)培養基;優質胎牛血清，10%;雙抗，1%。

　　2) 培養條件： 氣相：空氣，95%;二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。

　　3) 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

　　二、細胞處理：

　　1) 凍存細胞的復蘇：

　　將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養基的培養瓶(或皿)中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

　　2) 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

　　對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

　　1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

　　2. 加入0.25%(w / v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中(T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL)，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘(難消化的細胞可以適當延長消化時間)，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。

　　3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養基以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

　　3)細胞凍存: 收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。

　　下面T25瓶為例;

　　1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.

　　2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

　　3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。